Olá Eliezer
Sim, é obrigatória a segregação. No PGDAS-D, após o desenquadramento você informa:
Receitas de transporte municipal - devem ser informadas como serviço sujeito a ISS
Receitas de transporte intermunicipal ou interestadual - devem ser informadas como serviço sujeito a ICMS
Não é permitido lançar tudo como serviço sem segregação. Pois as NFS-e descrevem que o transporte ocorreu entre municípios ou estados e isso reforça a obrigatoriedade da segregação. Em fiscalização, a ausência de segregação gera: recolhimento incorreto; auto de infração; cobrança retroativa de ICMS + multa + juros.
Enquanto for MEI, pode emitir apenas NFS-e. Deixou de ser MEI, CT-e é obrigatório.
Espero ter ajudado.